Es la pregunta que recibimos en casi todas las cotizaciones de NGS: «¿a cuánta profundidad secuencio?». Y la respuesta honesta es que depende de la pregunta científica, no del presupuesto: pedir de más quema recursos que podrían ir a más muestras, y pedir de menos convierte el proyecto entero en datos poco concluyentes. Esta guía resume los números de consenso y, más importante, el razonamiento detrás de cada uno.
Cobertura: definición operativa
La cobertura media es el número de veces que cada base del genoma queda leída, en promedio: (nº de lecturas × longitud de lectura) ÷ tamaño del genoma. Decir «30x» significa que una posición típica está cubierta por unas 30 lecturas independientes — y eso es lo que permite distinguir una variante real (presente en ~15 de 30 lecturas si es heterocigota) de un error de secuenciación aislado.
Dos matices que importan tanto como la media: la uniformidad (de nada sirve un promedio de 30x si regiones enteras quedan a 5x — por eso se reporta también el «% de bases ≥20x») y, en exoma, la distinción entre cobertura bruta y on-target: solo cuentan las lecturas que caen dentro de las regiones capturadas, después de eliminar duplicados de PCR.
Recomendaciones por aplicación
| Aplicación | Cobertura sugerida |
|---|---|
| WGS humano · variantes germinales | 30x |
| WGS humano · variantes somáticas (cáncer) | 60x tumor + 30x normal |
| WES humano · diagnóstico clínico | >100x on-target |
| WGS bacteriano · ensamblaje | 50–100x |
| RNA-Seq · DEG | 20–30M reads/muestra |
| RNA-Seq · isoforma / lncRNA | 50–80M reads/muestra |
Trade-offs reales
El costo escala de forma casi lineal con la profundidad; la información, no. Para variantes germinales, la sensibilidad de detección de SNVs se acerca a su techo alrededor de 30x — subir a 60x encarece el proyecto sin apenas mejorar el llamado de variantes comunes. El caso somático es distinto: para detectar una mutación presente en el 5–10 % de las lecturas de un tumor heterogéneo, la estadística exige muchas más observaciones por posición, y por eso los diseños oncológicos parten de 60x (o cientos de x en paneles dirigidos).
"Doblar la cobertura no significa doblar la información. Tras cierto umbral, los retornos decrecen rápidamente."
La consecuencia práctica: cuando sobra presupuesto, casi siempre rinde más invertirlo en más muestras o más réplicas que en más profundidad. En RNA-Seq esto es especialmente claro — para expresión diferencial, 3 réplicas a 20M de lecturas superan con holgura a 1 muestra a 60M, porque la variabilidad biológica domina sobre la técnica.
Cuándo pedir long reads
Hay preguntas donde la profundidad no resuelve el problema porque el límite es la longitud de la lectura: variantes estructurales y regiones repetitivas (donde las lecturas cortas no se alinean de forma única), ensamblajes de novo de organismos sin genoma de referencia, faseo de haplotipos e isoformas completas de ARN. Para esos casos ofrecemos PacBio (HiFi) — y a menudo la estrategia ganadora es híbrida: long reads para armar el esqueleto y lecturas cortas Illumina para pulir la exactitud por base a bajo costo.
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