¿Qué es la secuenciación Sanger y cómo funciona?

La secuenciación Sanger — también llamada secuenciación por terminación de cadena o secuenciación capilar — es un método para determinar el orden exacto de los nucleótidos (A, T, G, C) de un fragmento de ADN. Fue desarrollada por Frederick Sanger en 1977, le valió su segundo Premio Nobel y, tras décadas de automatización, sigue siendo el estándar de referencia para lecturas individuales de alta precisión: verificación de clones y plásmidos, identificación microbiana y validación de variantes detectadas por NGS.

1. La idea central: terminadores de cadena

La reacción de secuenciación se parece a una PCR con un solo primer, pero con un ingrediente extra decisivo: además de los cuatro nucleótidos normales (dNTP), la mezcla contiene una pequeña proporción de dideoxinucleótidos (ddNTP), cada uno marcado con un fluorocromo de color distinto.

• La polimerasa copia el molde a partir del primer, incorporando nucleótidos uno a uno.
• Cuando por azar incorpora un ddNTP, la cadena no puede seguir creciendo: el ddNTP carece del grupo 3′-OH necesario para el siguiente enlace.
• Tras ~25 ciclos, el tubo contiene millones de fragmentos de todas las longitudes posibles, cada uno terminado en un ddNTP fluorescente que delata cuál es su última base.

Esta reacción con ciclos de desnaturalización y extensión se llama cycle sequencing, y la química de terminadores estándar de la plataforma es BigDye (Applied Biosystems), descrita en detalle en la guía de química del fabricante.

Ese es todo el truco: si consigues ordenar los fragmentos por tamaño con resolución de una sola base, el color del extremo de cada fragmento te deletrea la secuencia, posición a posición.

2. Electroforesis capilar: ordenar por tamaño

La separación se hace por electroforesis capilar. En Macrogen usamos secuenciadores ABI 3730xl de 96 capilares: cada capilar es un tubo finísimo relleno de polímero por el que los fragmentos migran bajo un campo eléctrico — los cortos avanzan más rápido que los largos.

Al final del capilar, un láser excita el fluorocromo de cada fragmento que pasa y una cámara registra el color. El resultado es una sucesión de picos de fluorescencia ordenados: el cromatograma o electroferograma, donde cada pico es una base de la secuencia.

3. Qué recibes: cromatograma, secuencia y calidad

De cada reacción obtienes dos archivos principales:

• .ab1 — el cromatograma crudo, con los picos de las cuatro bases. Es la evidencia primaria: cualquier duda sobre una base se resuelve mirando su pico. El convenio de colores del software es siempre el mismo: A verde, C azul, G negro, T rojo.
• .seq / FASTA — la secuencia de texto ya interpretada (base calling).

Cada base lleva asociado un valor de calidad Phred (QV): QV20 significa 1 error esperado cada 100 bases (99 % de exactitud); QV30, 1 cada 1.000; QV40, 1 cada 10.000. Un buen resultado tiene una zona central larga con QV>30 y extremos (los primeros ~20–40 nt y el final de la lectura) de menor calidad — eso es normal y esperable, no un fallo. Explicamos cómo leer todo esto en detalle en cómo interpretar un cromatograma Sanger.

4. Fortalezas y límites del método

Fortalezas	Límites
Precisión >99,9 % por lectura, sin necesidad de cobertura	Una reacción = una lectura de un locus (no es masivo)
Cromatograma trazable, aceptado como evidencia primaria	Lecturas de hasta ~1 kb; regiones más largas requieren primer walking
Económico para pocas muestras y pocos loci	Pierde sensibilidad con variantes por debajo de ~15–20 % de frecuencia alélica
Sin bioinformática compleja: el resultado se lee directamente	Los primeros 20–40 nt tras el primer tienen baja calidad
Detecta heterocigotos como picos dobles interpretables	Homopolímeros y estructuras secundarias pueden degradar la lectura

Cuando el proyecto exige miles de loci en paralelo, descubrimiento de variantes o cuantificación, la respuesta es NGS — comparamos ambos escenarios en Sanger vs NGS: cuándo elegir cada uno.

5. Aplicaciones típicas

1. Verificación de clones y plásmidos — confirmar que el inserto es el correcto y está en marco. Con primers universales (M13, T7, SP6…) ni siquiera necesitas diseñar primers propios.
2. Validación de variantes NGS — el paso obligado antes de un reporte clínico o una publicación.
3. Identificación microbiana 16S/ITS — secuenciar el gen 16S rRNA (bacterias) o la región ITS (hongos) y comparar por BLAST.
4. Genotipado dirigido — confirmar una mutación conocida en un gen concreto, muestra a muestra.
5. Control de calidad de síntesis — verificar genes sintéticos y construcciones antes de usarlas.

6. El flujo de trabajo con Macrogen, paso a paso

1. Prepara el molde: plásmido purificado o producto de PCR, a la concentración recomendada — está todo en nuestra guía de preparación de muestras.
2. Elige el primer: uno de los 96 primers universales gratuitos o el tuyo propio (5–10 pmol/µL).
3. Registra el pedido en el portal y envía las muestras a nuestro hub de Madrid o Santiago siguiendo la guía de envío.
4. Recibe los resultados en 24–48 h: archivos .ab1 + secuencia, descargables desde el portal.

Los precios parten de 4,2 € / USD 4,5 por muestra en formato Premix y bajan de 3 € / USD 3 por muestra en placas de 96 pocillos. El detalle completo de formatos y tarifas está en la página del servicio de secuenciación Sanger.

7. Preguntas rápidas

¿Sanger está obsoleto por el NGS? No. Cambió de rol: de leer genomas (Proyecto Genoma Humano) a ser la herramienta de precisión para lecturas puntuales y validación. Los organismos reguladores siguen aceptando el cromatograma como evidencia primaria.

¿Cuánto ADN puedo leer de una vez? Una reacción cubre hasta ~1.050 bases útiles. Para un inserto de 3 kb se combinan varias reacciones con primers escalonados (primer walking).

¿Sirve para ARN? Directamente no: primero se retrotranscribe a cDNA y se secuencia el cDNA.

¿Dudas sobre si tu proyecto encaja en Sanger? Escríbenos a info-spain@macrogen.com o info-chile@macrogen.com · te orientamos en 24 h.